ЧДК,микробиология, техника и приемы работы микробиолога.

Форум самогонщиков, пивоваров, виноделов Пивоварение Приготовление пива
1 2 3 4 ... 13 1
lovky Научный сотрудник Ульяновск 1236 1014
23 Марта 16, 17:20
В этой теме я предлагаю делится на благо нам всем .Обо всем что мы знаем про контаминацию напитков брожения а так-же котаминантов (врага надо знать в лицо Улыбающийся), описание и жизнедеятельность дрожжевых клеток различных штаммов-рас а так-же более высокой ступеньки ,их видов. Приемы работы с культурами микроорганизмов и маленькие хитрости. А так-же описание различных инструментов и приспособлений для работы .
lovky Научный сотрудник Ульяновск 1236 1014
Отв.1  23 Марта 16, 19:41
В этом посте я буду добавлять литературу , научные статьи, Ибо книга источник знаний ну и конечно рекомендации к прочтению.
Всем начинающим микробиологам советую сразу прочитать руководство к практическим занятиям . Сразу многие вопросы отпадут.
lovky Научный сотрудник Ульяновск 1236 1014
Отв.2  23 Марта 16, 19:42, через 1 мин
Выделение Чистой культуры микроорганизмов капельным методом Лиднера.
Краткая предистория... Если вы после посева по Коху на чашку видите замечательные красивые колонии. Это еще ничего не значит АБСОЛЮТНО !!!! . Не далее как вчера я засеял свой пропагатор уже разведенными дрожжами . Суть такая культура прилетела ко мне обычным письмом на фильтр бумаге от одного из наших коллег. Была высеяна таким образом ФБ--пробирка со стерильным суслом--чашка петри--косяк. дело было более месяца назад ничего под микроскопом я не просматривал на чашке идеально чисто. Я по простоте душевной думал что у меня на косяке ЧКД !!! но не тут то было.....Захотелось мне пивка сварить на этих дрожжах ну и поехали косяк---5мл стерильного сусла---50 мл стерильного сусла--- 500 мл стерильного сусла---пропагатор. Вроде все как всегда. Но я обычно перед засевом цкт просматриваю что-же наросло в пропагаторе ну и считаю клетки . И что-же я вижу .....Правильно контаминацию не сказать что-бы ах (менее 3%) но как говорится звоночек поступил. Варка конечно отменяется (какая уж тут варка) хотя и дрожжи пшеничные Улыбающийся и вроде кислинка по стилю но ну ее на.. Да и культуру спасать надо . Сегодня я буду пытаться сделать это.
Итак . Что нам понадобится:
Оборудование и инструменты:
1- микроскоп с нормально настроенным освещением по Келлеру и объективами 4,10,20,40или60хх, окуляры 10х или 15х
2- стекла покровные обычные толщиной 0.17мм
3- стекла предметные с лункой это обязательное условие на обычных предметных стеклах невозможно смотреть препарат типа "висячая капля" и несколько обычных передметных стекол
4- микроманипулятор (ужс сам как хочу но останавливает ценник)и поэтому будем использовать перо для письма №11 с перодержателем (сам не знаю откуда они у меня наверное из прошлой жизни)
5- горелочка очень желательно миниатюрная
6- пинцеты
7- петля микробиологическая
8- шкаф сухожарочный (для всех наверное это будет обычная духовка)
материалы:
1- бумага фильтровальная
2- колба на 100мл с ватно-марлевой пробкой или какой-то другой сосуд для стерилизации
3- сусло стерильное в пробирках по 5-10 мл
4 - зараженная культура очень желательно в стадии роста.
5 - вазелин Улыбающийся
6 - спирт

Начинаем Улыбающийся
мы имеем зараженую культуру которая совсем не ЧКД а вполне вероятно что это смесь разных культур . В частном случае это дрожжи и мкб с еще какой-то гадостью
первое что нужно сделать это довести в пробирке этот микс до стадии размножения деления дрожжевых клеток (назовем ее пробирка №1). Это прекрасно видно под микроскопом и позволит нам в дальнейшем отделять живые клетки от не живых (ведь трупы почковаться не умеют Улыбающийся)) ну и разных мутантов отсеивать.
Как только наша культура начала активно размножаться и дрожжи и патогенная микрофлора.(клетки дали по 3-4 детки по времени это обычно 12-24 часа) Нужно сделать посев стерильной петлей в стерильное сусло. В моем случае это 10 мл (пробирка №2)стерильного сусла и я в него инокулирую 3-4 полных петли из пробирки №1. Пробирку № 2 перемешиваем.
Пробирку № 1 можно отставить в сторону она нам больше не нужна.
далее в дело вступают предметные и покровные стекла, писчее перо и горелка.
Все стекла должны быть тщательно обезжирены спиртом и насухо вытерты как покровные тик и предметные.Далее стекла обжигаем стекла с лункой обжигаются в пламени горелки как сама лунка так и стекло вокруг лунки. Пока стекло горячее наносим вокруг лунки зубочисткой стерильный вазелин. Тем самым создавая "влажную камеру". Стекла обожгли намазали и перевернули что-бы лунки оказались как-бы в подвешенном состоянии (бактерии снизу вверх не летают) . Подготавливаем покровные стекла. Тоже обжигаем и переворачиваем . Кладем их на край предметных. Обжигаем обычное предметное стекло и кладем его рядом во всеми остальными (мы будем на нем оставлять лишнюю среду так как капли получаются сначала очеь большие).Обмакиваем перо в спирт и обжигаем его в пламени горелки до красна охлаждаем опять в спирте и подсушиваем в пламени горелки еще раз ждем до полного остывания.
Берм пером не большое кол-во инокулята из пробирки № 2 и начинаем рисовать точки на предметном стекле. как только размер точки будет не большим (подбирается экспериментально) . Поднимаем покровное стекло и рисуем точки уже на нем (1-2-3 до 10 штук.). Быстро переворачиваем предметное стекло и кладем на него наше предметное стекло точками вниз как-бы в лунку. Разглаживаем зубочистой вазелин чтобы образовалось непрерывное кольцо . У нас получилась влажная камера. Делать эту операцию надо довольно-таки быстро потому что среда сохнет. Перевели дух Улыбающийся и наш готовый препарат "висячая капля" под микроскоп. Выглядывать патогенку и кол-во дрожжевых клеток и их состояние. (клеток должно быть не много не более 5 почкующиеся считаем за одну). Патогенов не должно быть вовсе. Если все у Вас получилось патогенки нет дрожжи есть. то дальше может быть 2 сценария.
1- свой препарат с культурой кладем в термостат и через сутки смотрим снова. Если культура жива и развивается то переносим ее стерильной фильтровальной бумагой в пробирку с суслом.
2 - препарат чистый клетки видны , патогенов нет. Стерильной петлей набираем стерильное сусло в петлю берем чашку с сусло агаром и рисуем на нем штрихи. Если все ОК то через 1-3 суток у вас вырастут на чашке колонии довольно таки удаленные друг от друга по кол-ву клеток насчитанных в вашем препарате Улыбающийся
Вот собственно и все Улыбающийся  
И да коллеги не забывайте про стерильность на всех этапах Улыбающийся))
DSC_0433.JPG
514x768 34Кб
DSC_0435.JPG
514x768 27Кб
DSC_0436.JPG
514x768 42Кб
DSC_0437.JPG
1024x685 60Кб
DSC_0438.JPG
514x768 39Кб
DSC_0439.JPG
1024x685 48Кб
DSC_0440.JPG
1024x685 37Кб
DSC_0441.JPG
1024x685 39Кб
DSC_0442.JPG
1024x685 63Кб
lovky Научный сотрудник Ульяновск 1236 1014
Отв.3  23 Марта 16, 19:42, через 1 мин
резерв
lovky Научный сотрудник Ульяновск 1236 1014
Отв.4  23 Марта 16, 19:42, через 1 мин
резерв
lovky Научный сотрудник Ульяновск 1236 1014
Отв.5  23 Марта 16, 19:42, через 1 мин
резерв
seregakras Специалист Тула 190 168
Отв.6  23 Марта 16, 19:50, через 8 мин
Снова вопрос: надо ли залитую чашку Петри перед засевом отправлять на карантин и на сколько?
lovky Научный сотрудник Ульяновск 1236 1014
Отв.7  23 Марта 16, 20:02, через 13 мин
seregakras, Есть 2 метода работы с чашками. 1й заключается в стерилизации чашек в сухожаре с последующим оооооочень аккуратным наливом в нее стерильного сусло-агара. И 2й в абсолютно не стерильные чашки наливается абсолютно не стерильный сусло-агар и в последующем автоклавируется 120 гр 30 мин. С последующим остыванием до температуры желирования сусло-агара в том-же автоклаве. Чем достигается абсолютная стерильность в чашке и на,в, питательной среде . То что не растет на сусло-агаре может запросто вырасти в пищеварительном тракте млекопитающего с херовыми последствиями к примеру escherichia coli. Я пользуюсь вторым методом и ни какого карантина не выдерживаю. По правилам микробиологии при первом методе надо выдержать залитые чашки в термостате при Т=30°С в течении 3-5 суток если все чисто то можешь использовать Улыбающийся
Владимир55 Научный сотрудник Новосибирск 5699 2722
Отв.8  23 Марта 16, 20:07, через 5 мин
escherichia colilovky, 23 Марта 16, 23:02
Эта-то чем тебе навредила (за некоторыми исключениями) постоянный житель нашей микрофлоры, а уж для науки вообще незаменима как дрозофила.)))
lovky Научный сотрудник Ульяновск 1236 1014
Отв.9  23 Марта 16, 20:08, через 2 мин
Владимир55, ага только СЭС при обнаружении в продуктах предприятие закрывает сразу Улыбающийся а так ни чем Улыбающийся
Да и вообще я чужую микробиоту в себя не хочу Подмигивающий Володь пусть читают коллеги ищут в интернете что это за зверюга такая Подмигивающий потихоньку и до КМАФаНм глядишь доберемся Подмигивающий
seregakras Специалист Тула 190 168
Отв.10  23 Марта 16, 20:25, через 17 мин
Просто руки надо мыть перед едой и не только)))
Юрис Специалист Курск 153 28
Отв.11  23 Марта 16, 20:42, через 17 мин
2й в абсолютно не стерильные чашки наливается абсолютно не стерильный сусло-агар и в последующем автоклавируется 120 гр 30 мин. С последующим остыванием до температуры желирования сусло-агара в том-же автоклаве.lovky, 23 Марта 16, 20:02

Маловат резерв, но если что, подвинемся.
Остыло, а затем переворачиваешь или нет, и вообще куда дальше их путь до засева. Чашки заворачиваешь в фольгу перед автоклавированием?

Добавлено через 2мин.:

Просто руки надо мыть перед едой и не только)))seregakras, 23 Марта 16, 20:25
не только руки, или не только перед едой))))

Добавлено через 2мин.:

(врага надо знать в лицо )lovky, 23 Марта 16, 17:20

Снимки их под микроскопом будут?
lovky Научный сотрудник Ульяновск 1236 1014
Отв.12  23 Марта 16, 21:03, через 22 мин
Просто руки надо мыть перед едой и не только)))seregakras, 23 Марта 16, 20:25
ага "мойте руки перед.... и зад Улыбающийся"
lovky Научный сотрудник Ульяновск 1236 1014
Отв.13  23 Марта 16, 21:08, через 5 мин
Остыло, а затем переворачиваешь или нет, и вообще куда дальше их путь до засева. Чашки заворачиваешь в фольгу перед автоклавированием?Юрис, 23 Марта 16, 20:42
Когда остыло до Т=45° достаю и переворачиваю ставя друг на друга как-бы в столбик . Это предотвращает образование конденсата в какой-то мере. В фольгу не заворачиваю (зачем Непонимающий) автоклавируется в биксе не менее 20-30 штук. После остывания ставится в шкаф на хранение а потом может использоваться в течении месяца пока сусло-агар не высох. Ну или если завернуть в парафильм то до года. но парафильм уж больно дорогой. Проще еще раз процедуру повторить.
Вообще нормальное положение чашки со средой перевернутое всегда.
Юрис Специалист Курск 153 28
Отв.14  23 Марта 16, 21:15, через 7 мин
автоклавируется в биксе не менее 20-30 штук. После остывания ставится в шкаф на хранениеlovky, 23 Марта 16, 21:08
Шкаф подразумевается ламинарный? Какая в шкафу температура?
lovky Научный сотрудник Ульяновск 1236 1014
Отв.15  23 Марта 16, 21:20, через 6 мин
бикс и шкафЮрис, 23 Марта 16, 21:15
шкаф может быть и обычный Улыбающийся а бикс это стерилизационная коробка из нержавейки https://ru.wikipedia.org/wiki/Бикс
Юрис Специалист Курск 153 28
Отв.16  23 Марта 16, 21:25, через 5 мин
шкаф может быть и обычныйlovky, 23 Марта 16, 21:20
Пока убирал вопрос про бикс, ты ответил. Про температуру короче ты не провоцируешь в термошкафе.
lovky Научный сотрудник Ульяновск 1236 1014
Отв.17  23 Марта 16, 21:36, через 11 мин
Ну а что провоцировать то Непонимающий по 4-6 месяцев косяки лежат месяц чашки +20 температура. в любом случае что-нибудь да проросло-бы.
Юрис Специалист Курск 153 28
Отв.18  23 Марта 16, 22:39
по 4-6 месяцев косяки лежат месяц чашки +20 температураlovky, 23 Марта 16, 21:36
Косяки в холодильнике при +1-3? Чашки заливаешь заблаговременно с запасом?
Ещё вопрос. Если чашки ничем не закрыты ни до автоклавирования ни после и хранятся в нестерильных условиях, то перед засевом вроде получается надо обработать края чашки в пламени горелки, а среда при этом не подплавляется?
Rust Научный сотрудник Н. Новгород 2043 1070
Отв.19  23 Марта 16, 22:41, через 3 мин
Тем расплодили, а инфы почти ноль Грустный Две темы насчет микроскопа еле живы