
ЧДК,микробиология, техника и приемы работы микробиолога.
lovky
Научный сотрудник
Ульяновск
1.2K 1K

23 Марта 16, 17:20
В этой теме я предлагаю делится на благо нам всем .Обо всем что мы знаем про контаминацию напитков брожения а так-же котаминантов (врага надо знать в лицо
), описание и жизнедеятельность дрожжевых клеток различных штаммов-рас а так-же более высокой ступеньки ,их видов. Приемы работы с культурами микроорганизмов и маленькие хитрости. А так-же описание различных инструментов и приспособлений для работы .

lovky
Научный сотрудник
Ульяновск
1.2K 1K

Отв.1 23 Марта 16, 19:41
В этом посте я буду добавлять литературу , научные статьи, Ибо книга источник знаний ну и конечно рекомендации к прочтению.
Всем начинающим микробиологам советую сразу прочитать руководство к практическим занятиям . Сразу многие вопросы отпадут.
Всем начинающим микробиологам советую сразу прочитать руководство к практическим занятиям . Сразу многие вопросы отпадут.
lovky
Научный сотрудник
Ульяновск
1.2K 1K

Отв.2 23 Марта 16, 19:42, через 1 мин
Выделение Чистой культуры микроорганизмов капельным методом Лиднера.
Краткая предистория... Если вы после посева по Коху на чашку видите замечательные красивые колонии. Это еще ничего не значит АБСОЛЮТНО !!!! . Не далее как вчера я засеял свой пропагатор уже разведенными дрожжами . Суть такая культура прилетела ко мне обычным письмом на фильтр бумаге от одного из наших коллег. Была высеяна таким образом ФБ--пробирка со стерильным суслом--чашка петри--косяк. дело было более месяца назад ничего под микроскопом я не просматривал на чашке идеально чисто. Я по простоте душевной думал что у меня на косяке ЧКД !!! но не тут то было.....Захотелось мне пивка сварить на этих дрожжах ну и поехали косяк---5мл стерильного сусла---50 мл стерильного сусла--- 500 мл стерильного сусла---пропагатор. Вроде все как всегда. Но я обычно перед засевом цкт просматриваю что-же наросло в пропагаторе ну и считаю клетки . И что-же я вижу .....Правильно контаминацию не сказать что-бы ах (менее 3%) но как говорится звоночек поступил. Варка конечно отменяется (какая уж тут варка) хотя и дрожжи пшеничные
и вроде кислинка по стилю но ну ее на.. Да и культуру спасать надо . Сегодня я буду пытаться сделать это.
Итак . Что нам понадобится:
Оборудование и инструменты:
1- микроскоп с нормально настроенным освещением по Келлеру и объективами 4,10,20,40или60хх, окуляры 10х или 15х
2- стекла покровные обычные толщиной 0.17мм
3- стекла предметные с лункой это обязательное условие на обычных предметных стеклах невозможно смотреть препарат типа "висячая капля" и несколько обычных передметных стекол
4- микроманипулятор (ужс сам как хочу но останавливает ценник)и поэтому будем использовать перо для письма №11 с перодержателем (сам не знаю откуда они у меня наверное из прошлой жизни)
5- горелочка очень желательно миниатюрная
6- пинцеты
7- петля микробиологическая
8- шкаф сухожарочный (для всех наверное это будет обычная духовка)
материалы:
1- бумага фильтровальная
2- колба на 100мл с ватно-марлевой пробкой или какой-то другой сосуд для стерилизации
3- сусло стерильное в пробирках по 5-10 мл
4 - зараженная культура очень желательно в стадии роста.
5 - вазелин
6 - спирт
Начинаем
мы имеем зараженую культуру которая совсем не ЧКД а вполне вероятно что это смесь разных культур . В частном случае это дрожжи и мкб с еще какой-то гадостью
первое что нужно сделать это довести в пробирке этот микс до стадии размножения деления дрожжевых клеток (назовем ее пробирка №1). Это прекрасно видно под микроскопом и позволит нам в дальнейшем отделять живые клетки от не живых (ведь трупы почковаться не умеют
)) ну и разных мутантов отсеивать.
Как только наша культура начала активно размножаться и дрожжи и патогенная микрофлора.(клетки дали по 3-4 детки по времени это обычно 12-24 часа) Нужно сделать посев стерильной петлей в стерильное сусло. В моем случае это 10 мл (пробирка №2)стерильного сусла и я в него инокулирую 3-4 полных петли из пробирки №1. Пробирку № 2 перемешиваем.
Пробирку № 1 можно отставить в сторону она нам больше не нужна.
далее в дело вступают предметные и покровные стекла, писчее перо и горелка.
Все стекла должны быть тщательно обезжирены спиртом и насухо вытерты как покровные тик и предметные.Далее стекла обжигаем стекла с лункой обжигаются в пламени горелки как сама лунка так и стекло вокруг лунки. Пока стекло горячее наносим вокруг лунки зубочисткой стерильный вазелин. Тем самым создавая "влажную камеру". Стекла обожгли намазали и перевернули что-бы лунки оказались как-бы в подвешенном состоянии (бактерии снизу вверх не летают) . Подготавливаем покровные стекла. Тоже обжигаем и переворачиваем . Кладем их на край предметных. Обжигаем обычное предметное стекло и кладем его рядом во всеми остальными (мы будем на нем оставлять лишнюю среду так как капли получаются сначала очеь большие).Обмакиваем перо в спирт и обжигаем его в пламени горелки до красна охлаждаем опять в спирте и подсушиваем в пламени горелки еще раз ждем до полного остывания.
Берм пером не большое кол-во инокулята из пробирки № 2 и начинаем рисовать точки на предметном стекле. как только размер точки будет не большим (подбирается экспериментально) . Поднимаем покровное стекло и рисуем точки уже на нем (1-2-3 до 10 штук.). Быстро переворачиваем предметное стекло и кладем на него наше предметное стекло точками вниз как-бы в лунку. Разглаживаем зубочистой вазелин чтобы образовалось непрерывное кольцо . У нас получилась влажная камера. Делать эту операцию надо довольно-таки быстро потому что среда сохнет. Перевели дух
и наш готовый препарат "висячая капля" под микроскоп. Выглядывать патогенку и кол-во дрожжевых клеток и их состояние. (клеток должно быть не много не более 5 почкующиеся считаем за одну). Патогенов не должно быть вовсе. Если все у Вас получилось патогенки нет дрожжи есть. то дальше может быть 2 сценария.
1- свой препарат с культурой кладем в термостат и через сутки смотрим снова. Если культура жива и развивается то переносим ее стерильной фильтровальной бумагой в пробирку с суслом.
2 - препарат чистый клетки видны , патогенов нет. Стерильной петлей набираем стерильное сусло в петлю берем чашку с сусло агаром и рисуем на нем штрихи. Если все ОК то через 1-3 суток у вас вырастут на чашке колонии довольно таки удаленные друг от друга по кол-ву клеток насчитанных в вашем препарате
Вот собственно и все
И да коллеги не забывайте про стерильность на всех этапах
))
Краткая предистория... Если вы после посева по Коху на чашку видите замечательные красивые колонии. Это еще ничего не значит АБСОЛЮТНО !!!! . Не далее как вчера я засеял свой пропагатор уже разведенными дрожжами . Суть такая культура прилетела ко мне обычным письмом на фильтр бумаге от одного из наших коллег. Была высеяна таким образом ФБ--пробирка со стерильным суслом--чашка петри--косяк. дело было более месяца назад ничего под микроскопом я не просматривал на чашке идеально чисто. Я по простоте душевной думал что у меня на косяке ЧКД !!! но не тут то было.....Захотелось мне пивка сварить на этих дрожжах ну и поехали косяк---5мл стерильного сусла---50 мл стерильного сусла--- 500 мл стерильного сусла---пропагатор. Вроде все как всегда. Но я обычно перед засевом цкт просматриваю что-же наросло в пропагаторе ну и считаю клетки . И что-же я вижу .....Правильно контаминацию не сказать что-бы ах (менее 3%) но как говорится звоночек поступил. Варка конечно отменяется (какая уж тут варка) хотя и дрожжи пшеничные

Итак . Что нам понадобится:
Оборудование и инструменты:
1- микроскоп с нормально настроенным освещением по Келлеру и объективами 4,10,20,40или60хх, окуляры 10х или 15х
2- стекла покровные обычные толщиной 0.17мм
3- стекла предметные с лункой это обязательное условие на обычных предметных стеклах невозможно смотреть препарат типа "висячая капля" и несколько обычных передметных стекол
4- микроманипулятор (ужс сам как хочу но останавливает ценник)и поэтому будем использовать перо для письма №11 с перодержателем (сам не знаю откуда они у меня наверное из прошлой жизни)
5- горелочка очень желательно миниатюрная
6- пинцеты
7- петля микробиологическая
8- шкаф сухожарочный (для всех наверное это будет обычная духовка)
материалы:
1- бумага фильтровальная
2- колба на 100мл с ватно-марлевой пробкой или какой-то другой сосуд для стерилизации
3- сусло стерильное в пробирках по 5-10 мл
4 - зараженная культура очень желательно в стадии роста.
5 - вазелин

6 - спирт
Начинаем

мы имеем зараженую культуру которая совсем не ЧКД а вполне вероятно что это смесь разных культур . В частном случае это дрожжи и мкб с еще какой-то гадостью
первое что нужно сделать это довести в пробирке этот микс до стадии размножения деления дрожжевых клеток (назовем ее пробирка №1). Это прекрасно видно под микроскопом и позволит нам в дальнейшем отделять живые клетки от не живых (ведь трупы почковаться не умеют

Как только наша культура начала активно размножаться и дрожжи и патогенная микрофлора.(клетки дали по 3-4 детки по времени это обычно 12-24 часа) Нужно сделать посев стерильной петлей в стерильное сусло. В моем случае это 10 мл (пробирка №2)стерильного сусла и я в него инокулирую 3-4 полных петли из пробирки №1. Пробирку № 2 перемешиваем.
Пробирку № 1 можно отставить в сторону она нам больше не нужна.
далее в дело вступают предметные и покровные стекла, писчее перо и горелка.
Все стекла должны быть тщательно обезжирены спиртом и насухо вытерты как покровные тик и предметные.Далее стекла обжигаем стекла с лункой обжигаются в пламени горелки как сама лунка так и стекло вокруг лунки. Пока стекло горячее наносим вокруг лунки зубочисткой стерильный вазелин. Тем самым создавая "влажную камеру". Стекла обожгли намазали и перевернули что-бы лунки оказались как-бы в подвешенном состоянии (бактерии снизу вверх не летают) . Подготавливаем покровные стекла. Тоже обжигаем и переворачиваем . Кладем их на край предметных. Обжигаем обычное предметное стекло и кладем его рядом во всеми остальными (мы будем на нем оставлять лишнюю среду так как капли получаются сначала очеь большие).Обмакиваем перо в спирт и обжигаем его в пламени горелки до красна охлаждаем опять в спирте и подсушиваем в пламени горелки еще раз ждем до полного остывания.
Берм пером не большое кол-во инокулята из пробирки № 2 и начинаем рисовать точки на предметном стекле. как только размер точки будет не большим (подбирается экспериментально) . Поднимаем покровное стекло и рисуем точки уже на нем (1-2-3 до 10 штук.). Быстро переворачиваем предметное стекло и кладем на него наше предметное стекло точками вниз как-бы в лунку. Разглаживаем зубочистой вазелин чтобы образовалось непрерывное кольцо . У нас получилась влажная камера. Делать эту операцию надо довольно-таки быстро потому что среда сохнет. Перевели дух

1- свой препарат с культурой кладем в термостат и через сутки смотрим снова. Если культура жива и развивается то переносим ее стерильной фильтровальной бумагой в пробирку с суслом.
2 - препарат чистый клетки видны , патогенов нет. Стерильной петлей набираем стерильное сусло в петлю берем чашку с сусло агаром и рисуем на нем штрихи. Если все ОК то через 1-3 суток у вас вырастут на чашке колонии довольно таки удаленные друг от друга по кол-ву клеток насчитанных в вашем препарате

Вот собственно и все

И да коллеги не забывайте про стерильность на всех этапах

lovky
Научный сотрудник
Ульяновск
1.2K 1K

Отв.3 23 Марта 16, 19:42, через 1 мин
резерв
lovky
Научный сотрудник
Ульяновск
1.2K 1K

Отв.4 23 Марта 16, 19:42, через 1 мин
резерв
lovky
Научный сотрудник
Ульяновск
1.2K 1K

Отв.5 23 Марта 16, 19:42, через 1 мин
резерв
seregakras
Специалист
Тула
198 188
Отв.6 23 Марта 16, 19:50, через 8 мин
Снова вопрос: надо ли залитую чашку Петри перед засевом отправлять на карантин и на сколько?
lovky
Научный сотрудник
Ульяновск
1.2K 1K

Отв.7 23 Марта 16, 20:02, через 13 мин
seregakras, Есть 2 метода работы с чашками. 1й заключается в стерилизации чашек в сухожаре с последующим оооооочень аккуратным наливом в нее стерильного сусло-агара. И 2й в абсолютно не стерильные чашки наливается абсолютно не стерильный сусло-агар и в последующем автоклавируется 120 гр 30 мин. С последующим остыванием до температуры желирования сусло-агара в том-же автоклаве. Чем достигается абсолютная стерильность в чашке и на,в, питательной среде . То что не растет на сусло-агаре может запросто вырасти в пищеварительном тракте млекопитающего с херовыми последствиями к примеру escherichia coli. Я пользуюсь вторым методом и ни какого карантина не выдерживаю. По правилам микробиологии при первом методе надо выдержать залитые чашки в термостате при Т=30°С в течении 3-5 суток если все чисто то можешь использовать

Владимир55
Научный сотрудник
Новосибирск
6.1K 2.8K

Отв.8 23 Марта 16, 20:07, через 5 мин
escherichia colilovky, 23 Марта 16, 23:02Эта-то чем тебе навредила (за некоторыми исключениями) постоянный житель нашей микрофлоры, а уж для науки вообще незаменима как дрозофила.)))
lovky
Научный сотрудник
Ульяновск
1.2K 1K

Отв.9 23 Марта 16, 20:08, через 2 мин
Владимир55, ага только СЭС при обнаружении в продуктах предприятие закрывает сразу
а так ни чем 
Да и вообще я чужую микробиоту в себя не хочу
Володь пусть читают коллеги ищут в интернете что это за зверюга такая
потихоньку и до КМАФаНм глядишь доберемся


Да и вообще я чужую микробиоту в себя не хочу



seregakras
Специалист
Тула
198 188
Отв.10 23 Марта 16, 20:25, через 17 мин
Просто руки надо мыть перед едой и не только)))
Юрис
Специалист
Курск
153 28
Отв.11 23 Марта 16, 20:42, через 17 мин
2й в абсолютно не стерильные чашки наливается абсолютно не стерильный сусло-агар и в последующем автоклавируется 120 гр 30 мин. С последующим остыванием до температуры желирования сусло-агара в том-же автоклаве.lovky, 23 Марта 16, 20:02
Маловат резерв, но если что, подвинемся.
Остыло, а затем переворачиваешь или нет, и вообще куда дальше их путь до засева. Чашки заворачиваешь в фольгу перед автоклавированием?
Добавлено через 2мин.:
Просто руки надо мыть перед едой и не только)))seregakras, 23 Марта 16, 20:25не только руки, или не только перед едой))))
Добавлено через 2мин.:
(врага надо знать в лицо )lovky, 23 Марта 16, 17:20
Снимки их под микроскопом будут?
lovky
Научный сотрудник
Ульяновск
1.2K 1K

Отв.12 23 Марта 16, 21:03, через 22 мин
Просто руки надо мыть перед едой и не только)))seregakras, 23 Марта 16, 20:25ага "мойте руки перед.... и зад

lovky
Научный сотрудник
Ульяновск
1.2K 1K

Отв.13 23 Марта 16, 21:08, через 5 мин
Остыло, а затем переворачиваешь или нет, и вообще куда дальше их путь до засева. Чашки заворачиваешь в фольгу перед автоклавированием?Юрис, 23 Марта 16, 20:42Когда остыло до Т=45° достаю и переворачиваю ставя друг на друга как-бы в столбик . Это предотвращает образование конденсата в какой-то мере. В фольгу не заворачиваю (зачем

Вообще нормальное положение чашки со средой перевернутое всегда.
Юрис
Специалист
Курск
153 28
Отв.14 23 Марта 16, 21:15, через 7 мин
автоклавируется в биксе не менее 20-30 штук. После остывания ставится в шкаф на хранениеlovky, 23 Марта 16, 21:08Шкаф подразумевается ламинарный? Какая в шкафу температура?
lovky
Научный сотрудник
Ульяновск
1.2K 1K

Отв.15 23 Марта 16, 21:20, через 6 мин
бикс и шкафЮрис, 23 Марта 16, 21:15шкаф может быть и обычный

Юрис
Специалист
Курск
153 28
Отв.16 23 Марта 16, 21:25, через 5 мин
шкаф может быть и обычныйlovky, 23 Марта 16, 21:20Пока убирал вопрос про бикс, ты ответил. Про температуру короче ты не провоцируешь в термошкафе.
lovky
Научный сотрудник
Ульяновск
1.2K 1K

Отв.17 23 Марта 16, 21:36, через 11 мин
Ну а что провоцировать то
по 4-6 месяцев косяки лежат месяц чашки +20 температура. в любом случае что-нибудь да проросло-бы.

Юрис
Специалист
Курск
153 28
Отв.18 23 Марта 16, 22:39
по 4-6 месяцев косяки лежат месяц чашки +20 температураlovky, 23 Марта 16, 21:36Косяки в холодильнике при +1-3? Чашки заливаешь заблаговременно с запасом?
Ещё вопрос. Если чашки ничем не закрыты ни до автоклавирования ни после и хранятся в нестерильных условиях, то перед засевом вроде получается надо обработать края чашки в пламени горелки, а среда при этом не подплавляется?
Rust
Научный сотрудник
там где мне хорошо
2.2K 1.2K

Отв.19 23 Марта 16, 22:41, через 3 мин
Тем расплодили, а инфы почти ноль
Две темы насчет микроскопа еле живы
