ЧДК,микробиология, техника и приемы работы микробиолога.

В этой теме я предлагаю делится на благо нам всем .Обо всем что мы знаем про контаминацию напитков брожения а так-же котаминантов (врага надо знать в лицо ), описание и жизнедеятельность дрожжевых клеток различных штаммов-рас а так-же более высокой ступеньки ,их видов. Приемы работы с культурами микроорганизмов и маленькие хитрости. А так-же описание различных инструментов и приспособлений для работы .

В этом посте я буду добавлять литературу , научные статьи, Ибо книга источник знаний ну и конечно рекомендации к прочтению.
Всем начинающим микробиологам советую сразу прочитать руководство к практическим занятиям . Сразу многие вопросы отпадут.

Выделение Чистой культуры микроорганизмов капельным методом Лиднера.
Краткая предистория... Если вы после посева по Коху на чашку видите замечательные красивые колонии. Это еще ничего не значит АБСОЛЮТНО !!!! . Не далее как вчера я засеял свой пропагатор уже разведенными дрожжами . Суть такая культура прилетела ко мне обычным письмом на фильтр бумаге от одного из наших коллег. Была высеяна таким образом ФБ--пробирка со стерильным суслом--чашка петри--косяк. дело было более месяца назад ничего под микроскопом я не просматривал на чашке идеально чисто. Я по простоте душевной думал что у меня на косяке ЧКД !!! но не тут то было.....Захотелось мне пивка сварить на этих дрожжах ну и поехали косяк---5мл стерильного сусла---50 мл стерильного сусла--- 500 мл стерильного сусла---пропагатор. Вроде все как всегда. Но я обычно перед засевом цкт просматриваю что-же наросло в пропагаторе ну и считаю клетки . И что-же я вижу .....Правильно контаминацию не сказать что-бы ах (менее 3%) но как говорится звоночек поступил. Варка конечно отменяется (какая уж тут варка) хотя и дрожжи пшеничные и вроде кислинка по стилю но ну ее на.. Да и культуру спасать надо . Сегодня я буду пытаться сделать это.
Итак . Что нам понадобится:
Оборудование и инструменты:
1- микроскоп с нормально настроенным освещением по Келлеру и объективами 4,10,20,40или60хх, окуляры 10х или 15х
2- стекла покровные обычные толщиной 0.17мм
3- стекла предметные с лункой это обязательное условие на обычных предметных стеклах невозможно смотреть препарат типа "висячая капля" и несколько обычных передметных стекол
4- микроманипулятор (ужс сам как хочу но останавливает ценник)и поэтому будем использовать перо для письма №11 с перодержателем (сам не знаю откуда они у меня наверное из прошлой жизни)
5- горелочка очень желательно миниатюрная
6- пинцеты
7- петля микробиологическая
8- шкаф сухожарочный (для всех наверное это будет обычная духовка)
материалы:
1- бумага фильтровальная
2- колба на 100мл с ватно-марлевой пробкой или какой-то другой сосуд для стерилизации
3- сусло стерильное в пробирках по 5-10 мл
4 - зараженная культура очень желательно в стадии роста.
5 - вазелин
6 - спирт

Начинаем
мы имеем зараженую культуру которая совсем не ЧКД а вполне вероятно что это смесь разных культур . В частном случае это дрожжи и мкб с еще какой-то гадостью
первое что нужно сделать это довести в пробирке этот микс до стадии размножения деления дрожжевых клеток (назовем ее пробирка №1). Это прекрасно видно под микроскопом и позволит нам в дальнейшем отделять живые клетки от не живых (ведь трупы почковаться не умеют )) ну и разных мутантов отсеивать.
Как только наша культура начала активно размножаться и дрожжи и патогенная микрофлора.(клетки дали по 3-4 детки по времени это обычно 12-24 часа) Нужно сделать посев стерильной петлей в стерильное сусло. В моем случае это 10 мл (пробирка №2)стерильного сусла и я в него инокулирую 3-4 полных петли из пробирки №1. Пробирку № 2 перемешиваем.
Пробирку № 1 можно отставить в сторону она нам больше не нужна.
далее в дело вступают предметные и покровные стекла, писчее перо и горелка.
Все стекла должны быть тщательно обезжирены спиртом и насухо вытерты как покровные тик и предметные.Далее стекла обжигаем стекла с лункой обжигаются в пламени горелки как сама лунка так и стекло вокруг лунки. Пока стекло горячее наносим вокруг лунки зубочисткой стерильный вазелин. Тем самым создавая "влажную камеру". Стекла обожгли намазали и перевернули что-бы лунки оказались как-бы в подвешенном состоянии (бактерии снизу вверх не летают) . Подготавливаем покровные стекла. Тоже обжигаем и переворачиваем . Кладем их на край предметных. Обжигаем обычное предметное стекло и кладем его рядом во всеми остальными (мы будем на нем оставлять лишнюю среду так как капли получаются сначала очеь большие).Обмакиваем перо в спирт и обжигаем его в пламени горелки до красна охлаждаем опять в спирте и подсушиваем в пламени горелки еще раз ждем до полного остывания.
Берм пером не большое кол-во инокулята из пробирки № 2 и начинаем рисовать точки на предметном стекле. как только размер точки будет не большим (подбирается экспериментально) . Поднимаем покровное стекло и рисуем точки уже на нем (1-2-3 до 10 штук.). Быстро переворачиваем предметное стекло и кладем на него наше предметное стекло точками вниз как-бы в лунку. Разглаживаем зубочистой вазелин чтобы образовалось непрерывное кольцо . У нас получилась влажная камера. Делать эту операцию надо довольно-таки быстро потому что среда сохнет. Перевели дух и наш готовый препарат "висячая капля" под микроскоп. Выглядывать патогенку и кол-во дрожжевых клеток и их состояние. (клеток должно быть не много не более 5 почкующиеся считаем за одну). Патогенов не должно быть вовсе. Если все у Вас получилось патогенки нет дрожжи есть. то дальше может быть 2 сценария.
1- свой препарат с культурой кладем в термостат и через сутки смотрим снова. Если культура жива и развивается то переносим ее стерильной фильтровальной бумагой в пробирку с суслом.
2 - препарат чистый клетки видны , патогенов нет. Стерильной петлей набираем стерильное сусло в петлю берем чашку с сусло агаром и рисуем на нем штрихи. Если все ОК то через 1-3 суток у вас вырастут на чашке колонии довольно таки удаленные друг от друга по кол-ву клеток насчитанных в вашем препарате
Вот собственно и все  
И да коллеги не забывайте про стерильность на всех этапах ))

резерв

резерв

резерв

Снова вопрос: надо ли залитую чашку Петри перед засевом отправлять на карантин и на сколько?

seregakras, Есть 2 метода работы с чашками. 1й заключается в стерилизации чашек в сухожаре с последующим оооооочень аккуратным наливом в нее стерильного сусло-агара. И 2й в абсолютно не стерильные чашки наливается абсолютно не стерильный сусло-агар и в последующем автоклавируется 120 гр 30 мин. С последующим остыванием до температуры желирования сусло-агара в том-же автоклаве. Чем достигается абсолютная стерильность в чашке и на,в, питательной среде . То что не растет на сусло-агаре может запросто вырасти в пищеварительном тракте млекопитающего с херовыми последствиями к примеру escherichia coli. Я пользуюсь вторым методом и ни какого карантина не выдерживаю. По правилам микробиологии при первом методе надо выдержать залитые чашки в термостате при Т=30°С в течении 3-5 суток если все чисто то можешь использовать

escherichia colilovky, 23 Марта 16, 23:02

Эта-то чем тебе навредила (за некоторыми исключениями) постоянный житель нашей микрофлоры, а уж для науки вообще незаменима как дрозофила.)))

Владимир55, ага только СЭС при обнаружении в продуктах предприятие закрывает сразу а так ни чем
Да и вообще я чужую микробиоту в себя не хочу Володь пусть читают коллеги ищут в интернете что это за зверюга такая потихоньку и до КМАФаНм глядишь доберемся

Просто руки надо мыть перед едой и не только)))

2й в абсолютно не стерильные чашки наливается абсолютно не стерильный сусло-агар и в последующем автоклавируется 120 гр 30 мин. С последующим остыванием до температуры желирования сусло-агара в том-же автоклаве.lovky, 23 Марта 16, 20:02

Маловат резерв, но если что, подвинемся.
Остыло, а затем переворачиваешь или нет, и вообще куда дальше их путь до засева. Чашки заворачиваешь в фольгу перед автоклавированием?

Добавлено через 2мин.:

Просто руки надо мыть перед едой и не только)))seregakras, 23 Марта 16, 20:25

не только руки, или не только перед едой))))

Добавлено через 2мин.:

(врага надо знать в лицо )lovky, 23 Марта 16, 17:20

Снимки их под микроскопом будут?

Просто руки надо мыть перед едой и не только)))seregakras, 23 Марта 16, 20:25

ага "мойте руки перед.... и зад "

Остыло, а затем переворачиваешь или нет, и вообще куда дальше их путь до засева. Чашки заворачиваешь в фольгу перед автоклавированием?Юрис, 23 Марта 16, 20:42

Когда остыло до Т=45° достаю и переворачиваю ставя друг на друга как-бы в столбик . Это предотвращает образование конденсата в какой-то мере. В фольгу не заворачиваю (зачем ) автоклавируется в биксе не менее 20-30 штук. После остывания ставится в шкаф на хранение а потом может использоваться в течении месяца пока сусло-агар не высох. Ну или если завернуть в парафильм то до года. но парафильм уж больно дорогой. Проще еще раз процедуру повторить.
Вообще нормальное положение чашки со средой перевернутое всегда.

автоклавируется в биксе не менее 20-30 штук. После остывания ставится в шкаф на хранениеlovky, 23 Марта 16, 21:08

Шкаф подразумевается ламинарный? Какая в шкафу температура?

бикс и шкафЮрис, 23 Марта 16, 21:15

шкаф может быть и обычный а бикс это стерилизационная коробка из нержавейки https://ru.wikipedia.org/wiki/Бикс

шкаф может быть и обычныйlovky, 23 Марта 16, 21:20

Пока убирал вопрос про бикс, ты ответил. Про температуру короче ты не провоцируешь в термошкафе.

Ну а что провоцировать то по 4-6 месяцев косяки лежат месяц чашки +20 температура. в любом случае что-нибудь да проросло-бы.

по 4-6 месяцев косяки лежат месяц чашки +20 температураlovky, 23 Марта 16, 21:36

Косяки в холодильнике при +1-3? Чашки заливаешь заблаговременно с запасом?
Ещё вопрос. Если чашки ничем не закрыты ни до автоклавирования ни после и хранятся в нестерильных условиях, то перед засевом вроде получается надо обработать края чашки в пламени горелки, а среда при этом не подплавляется?

Тем расплодили, а инфы почти ноль Две темы насчет микроскопа еле живы