ЧДК,микробиология, техника и приемы работы микробиолога.

Подскажите, сколько по времени можно хранить дрожжи на агаре. И в каких условиях. Спасибо.

Андрей100, из книги Криса Вайта

по факту, хранить можно пока не сдохнут. Как показала практика, даже если в результате долгого хранения на уклоне выжил совсем малый процент, дрожжи в общем сохраняют особенности свойственные данному штамму. Источники же в идеале рекомендуют пересев один раз в 2-3 месяца вначале на охмелённое сусло,а затем на сусло - агар.

ps. На днях вполне успешно разбродил матрас WY3942 Belgian Wheat после ровно полугодовалого срока хранения в холодильнике.

Так а что насчёт заморозки с 10%раствором глюкозы?

Отрывки из книги "First step in yeast culture" Pierre Rajotte.
Редактора у меня пока нет, так что обо всех ошибках и опечатках пишите в ЛС, буду исправлять.

Технология стерилизации

  Залогом успеха всех микробиологических операция является стерильность материалов, среды и инструментов. Когда мы говорим о стерильности мы имеем ввиду, что все формы жизни были уничтожены. Это значит полное отсутствие вегетативных клеток или их спор.

Стерилизация сухим жаром

  Как правило стерильность достигается температурой в 170 С с выдержкой по крайней мере 45 минут. Это означает, что для сухого жара подходит оборудование, которое нужно сохранять сухим, хорошо переносит высокие температуры, и обладает хорошей теплопроводностью. В эту категорию ходят все стеклянные сосуды и контейнеры, которые слишком велики для автоклава.
  Авторы учебников по микробиологии не всегда согласны друг с другом о лучшей температуре. В таблице ниже представлены их рекомендации:

  У меня есть собственно мнение. Все зависит от того что вы стерилизуете. Если это стекло или нержавеющая сталь, 170 С на 45 минут должно быть достаточно. Единственное, когда нужно быть более осторожным это если в том, что вы хотите обработать есть хлопковые пробка, как например в пробирках. Белый хлопок до процедуры приобретает кремовый цвет при 150 С. При более длительной выдержке хлопок желтеет. Пожелтение можно считать признаком окончания стерилизации. При 180 в хлопке формируются различные смолы, которые снижают фильтрующую способность, так же хлопок может стать коричневым и даже черным.
  Эти особенности можно использовать для проверки вашего оборудования. Просто положите что ни будь из хлопка в печь и включите на 160 С. Через 45 минут хлопок должен поменять цвет с белого на от кремового до желтый.

Стерилизация под давлением

  Хотя нагревание до 100 С эффективно разрушает вегетативные клетки, общепринятым способом для абсолютной стерильности является влажный жар под давлением. Это единственный способ уничтожить и бактерии, и их споры. Споры погибают только когда температура достигает 121 С и держится хотя бы 15 минут. Споры могут сохранять жизнеспособность при 100 С несколько часов. Они так же устойчивы к сухому жару. Споры не являются главной опасностью для пива и сусла. Стерилизация под давлением в основном нужна что бы разрушить споры плесени, которые могут прорасти на поверхности питательного агара.

Как получить температуру для стерилизации

  Достижение температуры в 121 С в автоколаве или скороварке основывается на простом факте, что чистый пар под давлением достигает больших температур чем температура закипания воды при атмосферном давлении.
  Очень важно работать именно с чистым паром. Под чистым паром понимается только водяной пар без примесей воздуха.

Как получить чистый пар

  В маленькой бытовой скороварке для этого нужно дать пару минут выйти воздуху. Для больших устройств рекомендуется подождать хотя бы 10 минут. Для устройств с манометром отсчет времени можно начинать только когда давление внутри достигнет 15 фунтов или одной атмосферы и затем стабилизируется. При этом давлении, с полностью вышедшим воздухом, температура будет 120С. Это давление нужно удерживать хотя бы 15 минут. Если объем стерилизуемой жидкости больше 500 мл следует немного увеличить время.

Сусло

  Для разведения дрожжей и приготовления стартера обычного охмеленного сусла более чем достаточно. На самом деле многие микробиологические среды, имеющиеся в продаже, не только для дрожжей, но и для других микроорганизмов основаны на пивном сусле.
  Старайтесь приготовить сусло из светлого базового солода
  На данном этапе я могу дать только одну рекомендацию. Предпочтительно что бы сусло, используемое в микробиологической практике, было приготовлено только из базового светлого солода. Это обеспечит унификацию базового сырья и избавит от влияния несбраживаемых сахаров из карамельных солодов.

Подготовка сусла к стерилизации

  Когда собираете сусло нужно убедиться, что вы его правильно декантировали. Холодная выдержка в течении 12 часов даст очень чистое сусло. Большинство тяжелых частиц осядет на дно. Необходимо охладить сусло как можно быстрее. Когда температура упадет до 40 С, поставьте его в холодильник.

Как получить кристально чистое стерилизованное сусло

  Когда собираете сусло нужно убедиться, что вы его правильно декантировали. Холодная выдержка в течении 12 часов даст очень чистое сусло. Большинство тяжелых частиц осядет на дно. Необходимо охладить сусло как можно быстрее. Когда температура упадет до 40 С, поставьте его в холодильник.

Как получить кристально чистое стерилизованное сусло

  Есть несколько путей получения чистого сусла. Первый путь — это использовать специальный сухой экстракт для лабораторий, второй путь – это аккуратно собрать чистое сусло из верхней части после стерилизации или отфильтровать сусло (после фильтрации, конечно, придется стерилизовать вторично), третий путь – очистить сусло с помощью яичного белка.
  Добавление белка в сусло позволяет удалить из него большинство не связанных частиц. Белка одного яйца хватит на два литра сусла. Для правильной работы, сусло должно быть температурой 50 С. Медленно добавьте белок в сусло помешивая его все это время. Медленно поднимайте температуру. Когда температура сусла немного поднимется консистенция и цвет сусла станет похож на молоко. Продолжайте поднимать температуру. Позже вы увидите образование хлопьев. Не доводите до кипени. Когда на поверхности сусла образуется шапка из белесых хлопьев снимите с огня. Остудите сусло и отфильтруйте его.

Твердые среды

Работа с агаром

  Для хорошего результата достаточно 12 гр. агара на 1 литр сусла. Налейте сусло комнатной температуры в кастрюлю и рассыпьте агар по поверхности. Дайте агару набухнуть пару минут, не перемешивайте. Вы увидите, когда агар набухнет достаточно. Поднимайте постепенно температуру, чтобы растворить агар. Осторожно доведите до кипения и кипятите сусло несколько минут.
  Стоит помнить, что раствор агара склонен к бурному кипению и выкипанию. Поэтому, необходимо поднимать температуру постепенно, и иметь 300% запаса пространства в кастрюле. Если выкипание произошло и часть раствора «убежала» лучшее, что можно сделать это вылить старый раствор и приготовить новый. Причина проста, в момент выкипания убежала лучшая часть раствора и из остатков не получится среда достаточно твердая для работы с ней.
  Приготовленный агар можно хранить в стерильной посуде достаточно долгое время.

Твердые среды

  Операции с чашками Петри — это основа пивоваренной микробиологии. На коммерческих пивоварнях их используют для обнаружения присутствия бактерий в пиве или сусле, а так же в ополаскивающей воде и окружающем воздухе. В лабораториях чашки используют для селекции отдельных колоний дрожжей.
  Есть два способа приготовить чашки Петри. Залить простерилизованный агар в простерилизованные чашки и дать им остыть или залить агар в чашки, а после этого простерилизовать.
  Так же стоит помнить, что после выключения нагрева с началом остывания автоклав начинает одновременно всасывать окружающий воздух, который, естественно, наполнен пылью и микроорганизмами, что обесценивает стерилизацию. Для борьбы с этим подачу воздуха при остывании следует организовать через фильтр.
  Для приготовления уклона в пробирку заливается 5 мл горячего агара, после под горлышко подставляется трубка и помещается в автоклав. Туда же ставят чашки петри. После остывания автоклава его нужно открыть и быстро завернуть все крышки, а чашки перевернуть.




Добавлено через 2мин.:

Стерильный перенос петлей

Для стерилизации петли необходимо последовательно раскалить проволоку петли, от основания к концу, до красного цвета. Все операции следует выполнять в области 5-6 см от пламени.
Что нужно для переноса
- горелка
- петля для переноса
- укос
- пробирка с суслом

Добавлено через 1мин.:

Стерильный перелив

  Подготовка:
  Сперва протрите пробирки крепким алкоголем. Для этого подойдет 70% алкоголь и безворсовая ткань. Это такая же важная процедура, как и стерилизация, лучше выполнять ее каждый раз.
  Спустите СО2 и разболтайте дрожжи до состояния суспензии. Это можно сделать незадолго до перелива.

Добавлено через 3мин.:

Засев чашек Петри

Способы отделения единичных клеток

  Для этого есть два метода. Взять образец петлей и разнести по поверхности. Или развести образец в стерильной воде, а потом разнести.
  Какой метод лучше? Первый метод дает высокую плотность колоний на чашке. Это выглядит как ковер из дрожжей. При этом трудно выбрать отдельную колонию.
  Второй способ дает достаточное распределение с первого разнесения. Легко выбрать отдельную колонию. Результат обоих методов может быть одинаковым.
  Возможно получить отдельные хорошо выраженные колонии без разбавления пробы. Для этого после первого разнесения возьмите следующую чашку и той же иглой (не берите новую пробу) разнесите еще раз затем повторите так же с третей чашкой.

Добавлено через 2мин.:

Разбавление

  Рассмотрим способ определения количества клеток в сусле. Для этого можно напрямую посчитать количество клеток в камере Горяева или подсчитать количество выросших колоний на чашке. В первом случае вам понадобится микроскоп во втором случае развести суспензию до достаточной концентрации.
  Вам понадобится:
- одна 10мл пипетка
- пять 1мл пипеток
- одна пустая пробирка
- пять пробирок со стерильной водой, 9мл воды в каждой

Добавлено через 1мин.:

Хранение дрожжей в растворе сахарозы

  Метод хранения дрожжей на уклоне очень хорош, но только если вы готовы делать пересадку каждые три месяца. Но также существует хороший забытый метод хранения дрожжей в растворе сахарозы. Он заключается в сохранении дрожжей в дремлющем состоянии путем помещения небольшой колонии в 10% раствор сахарозы.
  Для приготовления раствора используйте водопроводную или родниковую воду, не используйте дистиллированную воду. Естественно перед использованием водопроводную воду нужно прокипятить или отфильтровать для избавления от хлора.
  Среди авторов нет единого мнения какую посуду использовать для хранения. Герметичную или допускающую контакт с воздухом. Могу сказать точно, что со временем раствор испаряется. Можно сказать, что правильно подготовленные дрожжи могут храниться в пробирке с винтовой крышкой почти вечно.
  Сколько дрожжей хранить
  По этому поводу все имеют одно мнение: настолько мало, как только возможно. Для начала возьмите свежие дрожжи. Поместите их в пробирку с 10 мл охмеленного сусла. Подождите несколько дней пока закончится брожение. Выпустите СО2 и взболтайте дрожжи. Петлей возьмите суспензию из пробирки и перенесите в пробирку с раствором сахара. Делайте все стерильно. Обожгите горлышко пробирки, а затем закройте.
  Может показаться что в пробирке нет дрожжей совсем. Не переживайте это нормально. Храните пробирку при комнатной температуре. Через четыре – пять дней можете ожидать увидеть белые хлопья в толще раствора или белый осадок ан дне. Покрутите пробирку в руке. Жидкость в пробирке будет немного белесой у дна. Это признак успеха.
Необходимо хранить пробирки строго в вертикальном положении. Если они упадут то вы потеряете все.
Одни авторы говорят, что дрожжи нужно хранить при комнатной температуре, другие, что в холодильнике. Я храню дрожжи в подвале. Зимой там бывает до 4 С, летом до 21 С. Но даже после трех лет хранения дрожжи уверенно оживают, когда нужно.
  Что происходит с дрожжами.
  Дрожжи в чистом сахаре бродят и размножаются очень медленно. Раствор сахара не содержит питательных веществ и почти не содержит воздуха. Дрожжи используют собственные резервы для синтеза питательных веществ. В результате ни каких мутаций. Так как дрожжей мало то никакой перенаселенности. Некоторые дрожжи могут умереть, питательные вещества, получившиеся из их клеток, будут усвоены оставшимися. Затем они впадут в спячку. Если вы перенесете в раствор сахара слишком много дрожжей вас постигнет неудача. Так же неудачной будет перенесение ослабленных дрожжей.
  Реанимация.
  Естественно когда вы сохраняете дрожжи таким способом остается немного живых дрожжей. Многие умрут. Небольшое число клеток сможет впасть в спячку.
  Для реанимации взболтайте дрожжи. Жидкость в пробирке побелеет. Петлей возьмите пробу и перенесите ее в пробирку с 10 мл охмеленного сусла. Поскольку клеток осталось немного, и они заметно ослаблены не ждите активности раньше 4-5 дней.
  Дальнейшее хранение.
  Для улучшения здоровья дрожжей я делаю еще несколько переносов, после этого можно разнести культуру на уклон, чашку или снова сохранить в растворе сахарозы.


Добавлено через 2мин.:

Бактерии

  При засевании чашек так же можно провести тест на наличие аэробных бактерий. Вид бактерий, которые могут расти на агаре из охмеленного сусла. Но на такой среде их можно обнаружить только при сильной концентрации. Если бактерий немного, то они заметны только на средах препятствующих росту дрожжей.
  Бактерии патогенные для качества пива такие как молочнокислые бактерии и педиококи так же нуждаются в особой среде для роста и должны культивироваться в среде СО2. Они видны только на средах останавливающих рост дрожжей.

Добавлено через 2мин.:

Посмотреть:

Вот счас глупость спрошу, а где эту сахорозу взять или как сделать?

Добрый день. Друзья у кого есть WLP320?

Южанин, dust_31, в каких условиях и как долго храните матрасы?alexmw2006, 15 Янв. 19, 00:44

alexmw2006, Фактически - 1 - 1,5 месяца. Теоретически, думаю, можно хранить и до трех месяцев, а потом смысл большого запаса клеток теряется, наверняка начинают гибнуть. Но это мое предположение, не проверял...Южанин, 15 Янв. 19, 08:24

alexmw2006, именно матрасы дольше 2-х месяцев наверное лучше не хранить, хотя это вероятно зависит в том числе и от штамма, многие и сушку переживают. Вчера разбраживал лагернные ровно 2 мес. и как-то они вяло стартовали, не сравнить со свежим матрасом. Это не отменяет возможности хранить штаммы на суслоагаре более долгое время между перезасевами. Ну и конечно зависит от температуры хранения, у меня хранятся в нижнем ящике холодильника, а там аж +8, это конечно много, нужно ближе к 0.  Но при всех этих заморочках и некоторых трудозатратах результат этой технологии очень радует.dust_31, 16 Янв. 19, 21:30

Изменю свои показания. В октябре сварил несколько партий пива из матрасов засеянных в январе, таким образом хранились они грубо 9 месяцев. Мера была вынужденная, так как пиво все кончилось и высевать на чашки не было времени. В итоге бродило все благополучно, английский эль (wlp002) уже пью, лагер (wlp830) еще бродит, но судя по активности стартера, все должно быть хорошо. В общем не ожидал что на матрасах останется такой большой процент живых клеток за такой срок. Получаются своеобразные дрожжевые консервы)

Добрый вечер. Ребята, может кто подскажет, где можно приобрести штам дрожжей 8а(м) ?

Вот счас глупость спрошу, а где эту сахорозу взять или как сделать?слепень, 13 Марта 19, 23:45

можно декстрозу

Что такое матрас?
Технология с глицерином и шприцами в морозильнике имеет право на жизнь или лучше делать стартер непосредственно с уклона? Как ещё можно делать заготовки по 5-10мл?